维多利亚vic登录地址农业资源与环境（本硕博班）专业课程介绍
分子生物学‖实验
Experiment of molecular biology
课程编号：03610014j
适用专业：农业资源与环境（本硕博班）
总学时数：16
总学分：0.5
课程类型：专业基础
先修课程：普通化学，有机化学，普通微生物学
大纲主撰人：刘华晶
内容简介
近年来分子生物学在医药卫生、农业、环保、轻工等领域有突飞猛进的发展，分子生物学实验技术已成为生命科学及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。本课程每个实验都要求学生动手进行实际操作。要求学生掌握基础的分子生物学实验技术，提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，为专业课程的学习及参加科研实践打下基础。
三、教学内容 ：
实验一、基因组DNA的分离
一．实验目的
掌握从菌丝中提取基因组DNA的方法。
采用改良的CTAB法，从菌丝体中提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，并在紫外分光光度计下测定其浓度，稀释标定到30ng/μl，置-20℃冰箱储存备用。
二．实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎菌丝的组织和细胞，由于细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)．十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)．十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA．RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
简言之，无论哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的
所需药品及配置：CTAB、氯仿、异戊醇、苯酚、异丙醇、乙醇、TE
（1）70%乙醇：浓度为95%的乙醇70ml加入25ml无菌去离子水，混匀；
（2）TE缓冲液（pH8.0）：10mmol/L Tris·HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）；
（3）TAE电泳缓冲液：
50×浓贮存液：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0），加水定容至1L；
1×工作液：0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA；
（4）0.5M EDTA（PH 8.0） 100ml：在80ml水中加入18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0（约2gNaOH颗粒），定容至100ml高压灭菌备用；
（5）5mol/L NaCl：800ml水中加入292.2g NaCl溶解，定容至1L，高压灭菌后备用；
（6）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：在900ml水中溶解100g SDS，加热至68℃助溶，加水至1L，分装备用；
（7）1M Tris-cl（PH 8.0）100 ml:12.11g Tris碱；ddH2O ，80ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100ml
8）2×CTAB 提取液（PH 8.0）：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl。即称取CTAB 2 g加蒸馏水40ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100ml具体配置为：CTAB2克，Nacl 8.182克，1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml，稀释至100ml
（9）PCA：Tris-平衡酚25ml，三氯甲烷24ml，异戊醇1ml，现用现配，不宜长时间存储；
（10）GoldView：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同：在100ml琼脂糖胶溶液中加入5ml GoldView即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA；
(11)3M的NaAC:40毫升去离子水，加40.81克三水合乙酸钠，冰醋酸调PH至5.2，定容至100毫升，灭菌。
实验步骤：改进CTAB法基因组DNA提取
（1）将准备好的菌丝放入研钵中，加液氮研磨成粉末后收集到1.5ml离心管中，每管中加入的菌丝粉末量约0.04克左右，注意：1）菌丝体上的水分要尽量少，这样方便将菌丝充分研磨成粉末；2）每一管中不要装入太多菌丝粉末，防止裂解不充分影响提取效果；3）粉末加入试管时一定要动作迅速，防止菌丝粉末融化成团降低裂解效果；4）研磨过程中保证菌丝一直处于液氮的液面以下，使菌丝处于冷冻状态，防止反复冻融造成DNA的降解；
{菌丝准备：将培养好的菌丝用纱布过滤进行收集，用无菌去离子水冲洗菌丝2～3次，洗去菌丝表面多余培养液等杂质，再用滤纸吸干菌丝上多余水分，置于烘箱中50℃烘干1小时（使菌丝进一步干燥，保证研磨提取效果），取出后置于－80℃冰箱冷冻保存。}
（2）往离心管中加入事先配制好的CTAB 提取液溶液0.3ml，颠倒震荡使菌丝与药品混合充分；
（3）放在水浴锅中，65℃水浴处理30min，每5min上下颠倒一次（不能剧烈震荡避免菌丝基因组DNA因震荡造成物理破坏）；10000rpm/min离心l0min取上清液。
（4）加入和上清液等体积的PCA溶液，颠倒混匀，放入离心机中10000rpm/min离心l0min；
（5）取上清，加入1/2体积的2%的CTAB，再加入和上清等体积的氯仿：异戊醇=24：1，震荡混匀，轻摇10分钟，10000rpm/min离心l0min，取上清液。
（6）重复步骤5，直至中间层无白色沉淀为止。
（7）取第6部的上清液，加入1/10体积的3M的NaAC，加入2倍体积的无水乙醇，将离心管置于－20℃，静置30min；
（7）12000rpm/min离心10min，弃上清，得到沉淀DNA，用70%乙醇浸洗沉淀2次，自然风干；
（8）待沉淀干燥，向管中加入适量TE缓冲液溶解沉淀；
（9）在含有0.5μg/ml核酸染料的1％琼脂糖凝胶上检测DNA样品的质量，并在紫外分光光度计下测定其浓度，稀释标定到50ng/μl，然后分装，－80℃保存。
第二种提取DNA方法，优点：杂质较少
实验二DNA纯化（按试剂盒操作）
一．实验目的
将已经提取的DNA进行纯化
二．实验原理
首先利用琼胶电泳将不同分子量的DNA片段分开,将某一特定分子量区域的琼胶切下,利用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出并浓缩.
实验材料 ( 6X gel-loading dye:15% Ficoll 400, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol ( 紫外光箱 ( 下列试剂来自GeneAid公司所售的Gel/PCR Fragment Extraction Kit: * DF Buffer * Wash Buffer * Elution Buffer:10mM Tris-HCl(pH8.5) * DF Column * 2ml Collection Tube
三、实验步骤
A.将欲分离之DNA混合物以0.7%琼胶电泳分离.
B.电泳后,将琼胶置於紫外光箱上观察,把含有欲纯化之DNA片段的琼胶部位切下.
C.将步骤B的琼胶以蓝色微量吸管尽可能戳碎.
D.加入500ml DF buffer,55oC作用10分钟,每2-3分钟摇晃数次,直至琼胶完全溶解.
E.将步骤D琼胶溶液全部吸入DF Column,并套上Collection Tube(收集过滤液).
F.8000rpm离心1分钟,将过滤液倒掉.
G.加入500ml Wash Buffer,8000rpm离心1分钟,过滤液倒掉.
H.14000rpm离心2分钟.
I.将DF Column转移至上另一乾净的微量离心管.加入15ml Elution Buffer,室温静置2分钟.
J.14000rpm离心2分钟,微量离心管内之液体即为纯化的DNA片段.
K.取0.5ml纯化的DNA加入4.5mlDDW及1ml 6x DNA loading dye,跑0.7%琼胶电泳,与marker比较,估计DNA的浓度.
实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一．实验目的
1．掌握制不同浓度的琼脂糖凝胶的方法。
2．学会用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。
二．实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular DNA ,简称ocDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA, 简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
三．仪器与试剂
（一）仪器
1．琼脂糖凝胶电泳系统
2．凝胶成像系统
3．微波炉
4．移液枪（二套包括1000、10-200、20-100、0.5-10、0.1-2.5微升）
（二）试剂
１．5×TAE（5倍体积的TAE贮存液）
配1000ml 5×TAE：
Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5mol/l EDTA 100ml（pH 8.0）
２．凝胶加样缓冲液（6×）
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%（w/v）
３．琼脂糖
４．核酸染料（goldview I型核酸染色剂 ）
四．实验步骤
１．制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb
0.35～60
0.61～20
0.70.8～10
0.90.5～7
1.20.4～6
1.50.2～4
2.00.1～3
称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，按100ml的凝胶加5μl的EB。
２．胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。加入电泳缓冲液至电泳槽中。
３．加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（可将上一次实验产物作电泳材料）加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。
４．电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
实验四 聚合酶链反应技术ITR-PCR技术
一．实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
二．实验原理
三．仪器与试剂
（一）仪器
１．PCR热循环仪
２．PCR管
３．琼脂糖凝胶电泳系统
４．凝胶成像系统
（二）材料与试剂
1．随机引物（10mer）（5μmol/L）：购买成品。
2．Tag酶
3．10×缓冲液
4．MgCl2：25mmol/L
5．dNTP：每种2.5mmol/L
四．实验步骤
1、选用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGC-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增5.8S rDNA及其两侧的ITS1和ITS2基因片段。PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
2、反应体积为50ul，其成分为：模板1μl，引物ITS 1和ITS 4 (2×10-5mol/L)各5μl（上海生工)， 10×PCR缓冲液(pH8.3) 5μl， dNTP (0.01mol/L) 4μl（TaKaRa）， Taq酶(5U/μL) 0.25μl（TaKaRa），超纯水30μl定容至50μl。
ITS-PCR扩增条件： 94℃预变性5 min；94℃1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循环36次， 72℃延伸10min，产物于4℃保存。
3．琼脂糖凝胶电泳
配制1%琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物电泳。稳压100-120 V（电压低带型整齐，分辨率高）。电泳结束后，紫外灯下观察结果。
教学大纲说明
一、教学目的、课程性质任务，与其他课程的关系，所需先修课程。
分子生物学是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，分子生物学已成为生物技术专业教学计划中重要的核心课程，因此它是十分重要的一门必修课程，是培养造就生物技术和生命科学高层次专门人才所需基本素质的重要课程。通过本课程的学习，可使学生在分子水平上去分析、理解生命的奥秘，并运用相关理论和原理去分析和解决实际问题，有利于提高学生科学素养、树立正确的科学观、培养分析问题解决问题的能力，为生物技术拓展和生命科学的纵深发展奠定坚实的基础。
二、教学要求及选编教材的依据。
教学活动能力培养要求：通过分子生物学知识的传授，培养学生从分子水平上去分析、理解生命现象与过程，培养学生思考与探索生命的奥秘的能力。通过分子生物学实验，培养学生基本的分子生物学实验技能和基本的科学素养，以及分析和解决实际问题的能力。
三、教学环节和教学方法。
分子生物学注意体现学生为主体、教师为主导的讨论式教学，多采用启发式、讨论式的教学方法，激发学生的学习积极性。主要使用多媒体，采取讲授和讨论相结合方式进行教学。
充分利用现代教育技术多媒体手段进行教学，理论联系实际，让学生通过实验更好的理解书本的知识，取得良好的效果。
四、改革思路和说明。
采取普遍联系的学习方法，结合先修课程，从遗传与信息表达的角度更多地思考，并与生物技术大实验相结合，理论联系实践。建议学生参与相关课题研究，关注学科发展前沿和分子生物技术的开发与利用。
